CULTIVOS IN VITRO

CULTIVOS IN VITRO

El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales.

El cultivo in vitro consiste en tomar un trocito de hoja, un embrión, una porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo.
Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles: utensilios, cámara de manipulación, etc., todo está desinfectado en autoclave.

Cultivo in vitro de árboles frutales 

 

El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales.
Un dato para dar una idea comercial es que en España había en 1.990 28 laboratorios dedicados a la producción de plantas por cultivo in vitro como negocio.
El cultivo in vitro consiste en tomar un trocito de hoja, un embrión, una porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo.
Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles: utensilios, cámara de manipulación, etc., todo está desinfectado en autoclave.
El cultivo in vitro es muy caro, entre otras cosas porque no se puede mecanizar. Sólo son rentables aquellos laboratorios muy grandes y con mucho mercado.
La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.



Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro:

• Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:
  
  - Micropropagación de estaquillas
  - Organogénesis de callos
  
• Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:
  
  - Cultivo de meristemos
  - Microinjerto in vitro
  
• Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.
  
• Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.
  
• Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.
  
• Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.
  
• Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.
  
• Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas:
  
  - Obtención rápida de homocigotos.
  - Producción de híbridos (frutos puros).

Condiciones del cultivo in vitro

• En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones.
  
• En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.
  
• El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias.
  
• Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.
  
• El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5.
  
• Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.
  
• El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.
  
• El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo.
  
• En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales.
  
• Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta.
  
• En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.

PROCEDIMIENTO DE LA COLORACION DE GRAM

contenidos:
 
  violeta cristal para gram
(violeta cristal genciana) r.l.            2 gr.
amonio oxalato r.l.                         1 gr.
agua desmineralizada tipo II           100 ml.

  lugol (solucion de yodo/yoduro) para gram
yodo metalico                                    0.4 gr.
potasio yoduro                                   0.6 gr.
agua desmineralizada tipo II               100 ml.

   alcohol acetona decolorante para gram
alcohol etilico al 96%                        80%
acetona r.l.                                        20%

   fuscina basica
fuscina basica r.l.                               0.3 gr.
fenol al 5%                                        90 ml.
alcohol etilico al 96%                         10 ml.

  
PROCEDIMIENTO:

1. cubrir la preparacion (placa) fijada con violeta cristal por (1) minuto.

2. lavar con agua eliminando el exceso de agua.

3. cubrir la preparacion (placa) con lugol por (1) minuto.

4. lavar con agua eliminando el exceso de agua.

5. decolorar la placa con alcohol acetona por 15-30 segundos hasta que la placa decolore totalmente.

6.  lavar con agua eliminando el exceso de agua.

7. cubrir la prepacion (placa) con fuscina basica por (1) minuto.

8.  lavar con agua eliminando el exceso de agua, dejar secar al aire.

9. examinar al microscopio con lente de inmersion de 100X.

COLORACION DE GRAM

La papaína es una enzima que se extrae del fruto llamado papaya y es este familia de las papaina que según el tipo de tejidos se encuentran relacionadas. Desde poder antiinflamatorio hasta distintas aplicaciones en procesos industriales se cuentan entre las propiedades de la papaína y que permite utilizar el fruto en distintas dolencias como un medicamento natural. Ésta se desnaturaliza con un pH de 8 y su temperatura debe de ser de 37ºc.
La papaína es una enzima similar a la pepsina humana. El crecimiento del negocio relacionado con ella ha sido tal en los últimos años que el mercado mundial se calcula en unos 100 millones de dólares anuales, de los cuales el 70% pertenece a las industrias relacionadas con la alimentación
La papaína se consigue por la extracción del látex, que es un líquido blanco obtenido mediante cortes en los frutos inmaduros. Luego, en laboratorio, se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel óptimo de calidad para la comercialización y uso. La enzima se usa en estado líquido y tiene una duración mínima de seis meses estando refrigerada.
La cualidad principal de la papaína es el uso como mejorador de las carnes, (ablandamiento y aclaramiento), y en el aclaramiento y para evitar la sedimentación en las cervezas por su acción en los enlaces de las proteínas.

bacterias microscopicos

extraccion de papaina...

La papaína es una enzima que se extrae del fruto llamado papaya y es este familia de las papaina que según el tipo de tejidos se encuentran relacionadas. Desde poder antiinflamatorio hasta distintas aplicaciones en procesos industriales se cuentan entre las propiedades de la papaína y que permite utilizar el fruto en distintas dolencias como un medicamento natural. Ésta se desnaturaliza con un pH de 8 y su temperatura debe de ser de 37ºc.
La papaína es una enzima similar a la pepsina humana. El crecimiento del negocio relacionado con ella ha sido tal en los últimos años que el mercado mundial se calcula en unos 100 millones de dólares anuales, de los cuales el 70% pertenece a las industrias relacionadas con la alimentación
La papaína se consigue por la extracción del látex, que es un líquido blanco obtenido mediante cortes en los frutos inmaduros. Luego, en laboratorio, se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel óptimo de calidad para la comercialización y uso. La enzima se usa en estado líquido y tiene una duración mínima de seis meses estando refrigerada.

La cualidad principal de la papaína es el uso como mejorador de las carnes, (ablandamiento y aclaramiento), y en el aclaramiento y para evitar la sedimentación en las cervezas por su acción en los enlaces de las proteínas.

El objetivo de este proceso es la division de promelina y papaina para poder comprobar la prueba positiva de obtencion de la sustancia.

EXTRACCION DE ALMIDON A TRAVES DE PAPAS

 Lavado y Pelado.

Los tubérculos son perfectamente lavados y pelados con ayuda del agua, quitando la suciedad, mientras que la cáscara es pelada por abrasión utilizando un sistema de raspado.

 Molido.

Las papas son rayadas hasta convertirlas en una pasta fina (crema).

• Extracción de Almidón.

Se separa el almidón de la celulosa, para ello se utiliza un extractor múltiple. Esta máquina, utilizando la fuerza centrífuga, tamiza (separa) el almidón de la celulosa (afrecho o fibra).

• Lavado y Concentración del Almidón.

“La lechada” que viene de los extractores contiene proteína, materia grasa, sustancias contaminantes, etc. Y sustancias insolubles como la celulosa y partículas del raspado. Esta leche es decepcionada en un tanque del cual se trasvasa, mediante una bomba, hacia los hidrociclones para quitarle toda el agua, lavarla y concentrarla.

• Desaguado.

El almidón es llevado a las centrífugas donde es desaguado hasta obtener una humedad del 38%. En estas condiciones el almidón es transportado mediante un gusano al secador instantáneo Flash Dryer.

• Secado.

El almidón húmedo es tratado mediante una corriente de aire caliente el cual al chocar con el almidón hace que éste se disperse. Simultáneamente, el aire se satura de la humedad del almidón.

• Tamizado.

Para que el almidón esté perfectamente refinado, se le tamiza en una floreadora.

• Ensacado y Pesado.

El producto se envasa en bolsas de polipropileno a través de un dosificador que se encuentra incorporado al tamizador antes mencionado. Luego es pesado y llevado al almacén de productos terminados.

• Almacenamiento del almidón.

El almidón obtenido se debe guardar en un lugar seco y fresco, construido especialmente para ello.

Ese es el proceso industrial y como ves hay dos pntos dificiles de hacer caseramente , el centrifugado de alta velocidad y los hidrociclones...

El objetivo de realizar estos pasos del proceso de la extraccion de almidon atravez de papa era saber que porcentaje de almidon se lograba obtener de la papa.

MULTIPLICACION DE BROTES

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases anteriores originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

Logramos realizar la practica con exito,descubriendo que la multiplicacion de brotes es el componente para terminar una face de medios de cultivo, logrando una mayor obtencion de plantas.

CONDICIONES NECESARIAS PARA LOS MEDIOS DE CULTIVO

1- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

MEDIOS DE CULTIVO...

Un medio de cultivo consiste en un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de microorganismos, células o incluso pequeñas plantas. Según qué se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido, semisólido y líquido. El objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación...

FASES PARA LA MICROPROPAGACION DE PLANTAS VEGETALES

FASE 0 - PREPARACION DE LA PLANTA MADRE O ESCOGIDO DEL MATERIAL SER DE BUENA CALIDAD ESTAR LIBRE DE ENFERMEDADES.

FASE I - ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES ASEPTICAS DESINFECCION Y REMOCION DE CONTAMINANTES CON: ALCOHOL 70 %, CLORO 10%, AGUA DIVISION DEL MATERIAL SIEMBRA DEL MATERIAL – EN EL MEDIO DE CULTIVO
FASE 0 ESCOGIDO DEL MATERIAL
FASE I ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO

FASE II – MULTIPLICACION DEL TEJIDO O BROTES EMBRIOGENESIS DE CELULAS SOMATICAS – A. INDUCCION DE CUALQUIER CELULA DE LA PLANTA A FORMAREMBRIONES PARA PRODUCIR UNA PLANTA COMPLETA. ESTABLECIMIENTO DE CALLO EN UN MEDIO QUE CONTENGA UNA FUENTE DE NITROGENO REDUCIDO Y UNA HORMONA A BASE DE AUXINA COMO EL 2,4-D. ESTIMULAR EL DESARROLLO DE CELULAS DE CALLOS PARA DESARROLLAR LAS PLANTAS. REMOCION DE AUXINAS O REDUCCION DE LA CONCENTRACION DEL MEDIO QUE ESTIMULA LA FORMACION DEL EMBRION SOMATICO. SIEMBRA DE LOS EMBRIONES

MEJORAMIENTO DEL DESARROLLO B. AXILAR LAS YEMAS AXILARES Y TERMINALES SE INDUCEN AL DESARROLLO IN VITRO. IN VITRO – PRODUCCION DE PLANTAS A NIVEL DE LABORATORIO EN TUBOS DE ENSAYO, PLACAS PETRI O BOTELLAS O ENVASES DE CRISTAL. DESARROLLAR O AUMENTAR EL NUMERO DE RETOÑOS POR YEMAS USANDO EL REGULADOR DE CRECIMIENTO CITOQUININAS.

FASE III – ENRAIZAMIENTO Y ACONDICIONAMIENTO GENERACION DE 2 A 4 SEMANAS DURANTE LAS CUALES LA PLANTULA DESARROLLA RAICES Y SE ACONDICIONA A CRECER A CIERTA TEMPERATURA. SE CAMBIAN LAS PLANTULAS A DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVOS PARA ESTIMULAR FORMACION DE RAICES Y CRECIMIENTO VEGETATIVO. ES LA FASE MAS COSTOSA DE LA MICROPROPAGACION PORQUE CONLLEVA EL 35-75 % DEL COSTO DE PRODUCCION.

FASE IV – ACLIMATACION EN VIVO ACLIMATACION – PROCESO POR EL CUAL EL ORGANISMO SE ADAPTA A CAMBIOS DEL AMBIENTE. SE DEBEN TENER BAJO SOMBRA Y CON HUMEDAD VARIOS DIAS. EN VIVO – PRODUCCION DE PLANTAS A NIVEL DE INVERNADERO O CAMPO. LOS RETOÑOS O PLANTULAS SE TRANSFIEREN A TIESTOS QUE CONTENGAN UN MEDIO DE APOYO PARA SU CRECIMIENTO. EL MEDIO PUEDE SER MEZCLAS CON: SUELO, PERLITA, VERMICULITA, ARENA, MUSGO

ETAPAS DEL PROCESO DE MICROPROPAGACION

Dentro del proceso de micropropagación se pueden diferenciar varias fases o etapas:
1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas


2: Introducción del material seleccionado in vitro


3: Multiplicación de brotes


4: Enraizamiento


5: Aclimatación


Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación de plantas in vitro y puede ser aplicada a diferentes especies vegetales.

¿que es la micropropagacion?

Micropropagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades. La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o mejoramiento genético. Se utiliza también la micropropagacion para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.